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UNcle多参数高通量蛋白质稳定性分析系统

GENGXINSHIJIAN:2019-09-24

简要描述:

河南快赢481YUJIANUncle:YIGEPINGTAI12ZHONGWENDINGXINGYINGYONGJIANCE$nUncleSHIYIGEJIANCEWENDINGXINGDEYITIHUAPINGTAI,KETONGGUOYITAIYIQISHIXIAN12ZHONGBUTONGDEYINGYONG。TACAIYONGYINGGUANG,JINGTAIGUANGSANSHE(SLS)HEDONGTAIGUANGSANSHE(DLS)DEJIANCEFANGFABIAOZHENGDANBAIZHIWENDINGXING(TU1)。 DUOZHONGJIANCEFANGFAYIWEIZHEKEYIDUITONGYIZHONGYANGPINJINXINGDUOCANSHUJIANCE,LIRURERONG,JUJIHEKELIDAXIAO。 WEILEDEDAOWANZHENGDEXINXI,XUYAOTONGSHICAIYONGGUANGSANSHEHEYINGGUANGDEJIANCEFANGFA,JISHIJUJIYANGAILEDANBAIZHIKELIDEBIANHUA,YINGGUANGYEKEYIJIAN

  1. 半数变性温度(Tm

河南快赢481TONGGUONEIYUANXINGYINGGUANGZHIJIEJIANCEDANBAIZHIDEZHANKAI,QUEDINGQIRONGJIEWENDU。SUIZHEDANBAIZHIDEZHANKAIHEANJISUANDEZHONGPAI,SEANSUANHELAOANSUANDEYINGGUANGBIANHUABIAOMINGDANBAIZHIDEGOUXIANGFASHENGBIANHUA。NEIYUANXINGYINGGUANGSHIZHIJIEGUANCHADANBAIZHIJIEZHEDIEDEFANGFAZHIYI,JISHIZAIJUJIKAISHIHOUYEKEYIZHEIYANGJIANCE,ZHEIYUJIYUGUANGSANSHEHUOLIANGREFADEFANGFABUTONG。ZHEIZHONGJIANCEFANGSHIKEYIDUIGOUJIANTIDEWENDINGXINGJINXINGPAIXUHUOBIJIAOBUTONGDEPEIFANGYIHUODEJIAOYOULIDETIAOJIAN。ZAIDADUOSHUQINGKUANGXIA,SUIZHEDANBAIZHIDEZHANKAI,YINGGUANGQIANGDUHUIFASHENGBIANHUAHUOFENGZHIPIAOYI。DANZHEIZHONGJIANCEFANGSHIYEYOUHENDUOLIWAI,HAODEFANGSHISHIDUISHUJUJINXINGFENXI。UncleJIANCEWANZHENGDEYINGGUANGGUANGPU,YIQUEBAOYONGYOUSUOXUDESUOYOUSHUJU,BINGYININXUYAODESUOYOUFANGSHIJINXINGFENXI。

 

UncleTONGGUOZHIJIECELIANGNEIZAIYINGGUANGDEZHANKAILAIQUEDINGDANBAIZHIDERONGHUAWENDU。SUIZHEDANBAIZHIDEZHANKAIHEANJISUANDEZHONGPAI,SEANSUANHELAOANSUANDEYINGGUANGBIANHUABIAOMINGQIGOUXIANGYEFASHENGBIANHUA。GUYOUYINGGUANGSHIGUANCHADANBAIZHIJIEZHEDIEDEZHIJIEFANG

 

 
   

河南快赢481TU1:Uncle:YIZHANSHIWENDINGXINGFENXIPINGTAI。

 

FAZHIYI,JISHIZAIJUHEKAISHIHOUYEKEYIZHEIYANGZUO,ZHEIYUJIYUGUANGSANSHEHUOLIANGREFADEFANGFABUTONG。 ZAIDADUOSHUQINGKUANGXIA,SUIZHEDANBAIZHIZHANKAI,YINGGUANGQIANGDUFASHENGBIANHUAHUOFENGZHIPIAOYI。 DANYEYOULIWAIDESHIHOU,HAODEFANGFASHIDUISHUJUJINXINGXITONGXINGFENXI。UncleCELIANGWANZHENGDEYINGGUANGGUANGPU,YIQUEBAOYONGYOUXUYAODESUOYOUSHUJU,BINGYININXUYAODEFANGSHIJINXINGFENXI。

 

2.聚集起始温度(Tagg)

TONGGUOZAILIANGGEBUTONGBOZHANGXIASHIYONGSLSTONGSHIJIANCEXIAOKELIHEDAKELI,LEJIEDANBAIZHIZAIRESHENGWENGUOCHENGZHONGRUHEYIJIHESHIJUJI,KEYIDUININDEGOUJIANTIHUOZHIJIJINXINGPAIXU,ZHAODAOFANGZHIHUOYANCHIJUJIKAISHIDEFULIAO。 YOUYUDANBAIZHIKEYIZHANKAIYEKEYIJUJI,YINCITONGSHIJIANCETmHETaggKEYIFANGBIANQUEDINGDANBAIHESHIZHANKAI,YIJIDAOZHIJUJIDEYUANYIN。 SHIYONGBUYILAIKELIDAXIAOBIANHUADEYINGGUANGFANGFA,JISHIZAIJUJIYIJINGKAISHIZHIHOUYEKEYICELIANGTm。

 

 

       
       
 

河南快赢481 TU2:LIANGZHONGBUTONGZHIJIPEIFANGZHONGKANGTIDERERONG(A)HEREJUJI(B)QUXIAN。     

 

 

Tm和Tagg组合检测方法:河南快赢481以多种制剂制备浓度为0.5mg / mL的单克隆抗体。将每种样品9μL加载到Uni管中,并以15-95℃的热升温运行,升温速率为0.3℃/分钟。选择荧光强度的BCM模型作为佳分析方法。

 

Tm结果:在制剂1中,抗体经历三个不同的转变,由软件确定发生在57.8℃,71.5℃和88.1℃(图2A)。因为蛋白质直到后来才展开,相同抗体在制剂2中显示出热稳定性的改善, 该条件下Tm为73.6℃。

 

Tagg结果:在蛋白质一次构像展开之后,266nm处的SLS(图2B)显示制剂1中的抗体在67℃下突然发生聚集。在大约78℃时,266nm处的信号强度达到最大值并且聚集的蛋白质开始沉淀。相反,制剂2中的相同抗体在整个热升温过程中几乎不显示聚集。此结果与SLS在473nm处(未示出)检测的结果相似。虽然蛋白质在67°C开始聚集,但在较高温度下,Tm2和Tm3仍可通过内源荧光检测到。

 

  1. 用SYPRO荧光染料检测半数变性温度

差示扫描荧光测定法(DSF)是确定熔融温度的经典高通量方法之一。蛋白质可与外在染料如SYPRO®Orange结合使用,当它与未折叠蛋白质的疏水表面结合时,会发生热变换。 该应用可用于蛋白质中很少或没有色氨酸残基的情况,或评估浓度非常低的蛋白质稳定性的情况。 与Uncle上的其他所有应用程序一样,该软件简化了数据分析,以节省时间。

 

方法:用SYPRO®Orange配制1 mg / mL的人单克隆抗体。 将9μL样品加载到Uni管中并以15℃至95℃的热升温运行,升温速率为0.5℃/分钟,激发波长为473nm。 Uncle分析软件使用510-680nm之间的曲线下的面积来计算曲线的拐点并分析数据。

 

结果:通过软件计算抗体在62.5℃和76.3℃下构象发生改变(图3)。 当蛋白质折叠时,来自SYPRO®河南快赢481染料被缓冲液的水性环境淬灭,荧光信号的强度很低。 当蛋白质在较高温度下展开时,随着疏水区域的暴露,信号显著增加,然后在变性蛋白质的解离和聚集后再次降低。

 
   

河南快赢481TU3:SHIYONGSYPRO®OrangeYINGGUANGRANLIAOJIANCEKANGTIDERERONGJIE。

 

4.△G(吉布斯自由能变)

QIANGZHIJIANGJIESHISHIWENWENDINGXINGPINGGUDEJIDINGTIDAIPIN,DANRESHENGWENFANGFABINGBUZONGNENGQUFENXIANGSIWENDINGXINGDETIAOJIAN。 DUIYUZHEIXIEJISHOUDEWENTI,ΔGZHIKETIGONGDANBAIZHIWENDINGXINGDEDINGLIANGJIANCE,TAKEZAIZHENGJIAOYINGLITIAOJIANXIACELIANG。 TONGGUOJIANGDANBAIZHIBAOLUYUHUAXUEBIANXINGJIZHONGBINGCELIANGQISUOCHANSHENGDEYINGGUANGBIANHUA,KEYIJISUANDANBAIGOUXIANGZHANKAISUOXUDENENGLIANG。

 

方法:制备含2至9.2M尿素的32个点的变性曲线,其中治疗性抗体的终浓度为864μg/ mL。 将样品在室温孵育过夜,确保反应达到平衡。取9μL样品分别加到Unis管中,并在25℃检测。

 

结果:图4显示抗体在350/330nm处的荧光比值与变性剂浓度的函数关系。蛋白质在变性剂浓度4.6M和6.3M下经历两种不同的构象改变。Uncle分析软件使用3-state模型拟合数据,计算在两种构象改变条件下的ΔG值分别为9.89kcal/mol和10.9kcal/ mol。 在室温下反应达到平衡时,首次次构象发生改变的变性蛋白质为0.06ppm,样品第二次发生构象改变时变性蛋白质为0.01ppm。

 

  1. 等温稳定性

DENGWENWENDINGXINGSHIWENDINGXINGPINGGUDELINGYIZHONGFANGFA。BUSHIJIANGWENDUSHENGGAOYIYINQIRONGHUAZHUANBIAN,ERSHIJIANGYANGPINZAILVEDIYUYUQITmDEWENDUXIABAOCHIGENGZHANGSHIJIAN。 JIANGYANGPINMIFENGZAIUniBISEGUANZHONG,WENDUKEBAOCHISHUXIAOSHIHUOSHUTIANERBUHUIZHENGFA。XUANZEZAIYINGGUANGHESLSMOSHIXIATONGSHIJIANCEYANGPINDEGOUXIANGZHANKAIHEJUJI,RUGUOXIANGLEJIEFENZIHUOJUJITIDEDAXIAORUHESUISHIJIANBIANHUA,QINGXUANZEDLS。

 

方法:河南快赢481以PBS(制剂A)和增加不同浓度精氨酸的PBS溶液(制剂B-E)配制终浓度1mg/mL的人抗体。 将每种样品9μL加载到Uni管中并在60℃下孵育36小时,该温度低于抗体的解链温度。

 

结果:图5显示在266nm处的光散射强度。随着精氨酸浓度的增加,聚集减少,在更长的孵育时间里,差异的幅度更明显。

 
   

TU4:ZHILIAOXINGKANGTIDEBIANXINGQUXIAN。TONGGUOUncle RUANJIANCAIYONG3-stateMOXINGJISUANBIAOZHONGDESHUZHI

 
   

河南快赢481TU5:ZAIWUZHONGBUTONGZHIJIPEIFANGZHONGKANGTIDEDENGWENJUJI。

 

6.热变性恢复

河南快赢481REBIANXINGHUIFUKEYIJIANCEDANBAIGOUXIANGZHANKAIDEKENIXING,HUOJIANCEWENDUBIANHUARUHEYINGXIANGFENZI。XUANZEYIGEWENDU(HUOJIGE),BINGSHANGXIASHENGGAO,GUANCHADANBAIZHISHIFOUKEYIZAIXUANZEDEZHIJIZHONGZHONGXINZHEDIE。XUANZEYINGGUANG,SLSMOSHITONGSHIJIANCEDANBAIGOUXIANGZHANKAI,ZHONGZHEDIEHEJUJI。RUGUOXIANGJIANCEDANBAIZHIDEGOUXIANGSUIZHELIUTIDONGLIXUELIJINGDAXIAOHESHIJIANDEGAIBIAN,KEXUANZESHOUJIDLSSHUJU。

 

方法:用PBS缓冲液制备终浓度5mg/mL的人抗体。将9μL样品加载到Uni管中,并在15°C至58°C的温度下运行三次温度升温,每个温度保持20分钟,然后在15°C至70°C温度下进行三次温度升温,每个温度保持20分钟。

 

结果:该图显示了通过在荧光信号的BCM模型下测量蛋白质的解折叠和重折叠,以及473nm处的光散射强度(图6)。当蛋白质升温至低于其Tm的温度时,看到的少量构象展开是部分可逆的,并且不会导致任何聚集体形成。然而,当温度升高至70℃时,较大的颗粒不可逆地形成,即使样品冷却至15℃,荧光信号仍然很高。

 

7.粒度与多分散性系数

河南快赢481DLSSHIYIZHONGGAOLINGMINDUDEGONGJU,YONGYUCELIANGRONGYEZHONGDANBAIZHIHEXIAOFENZIDELIUTIDONGLIXUELIJINGDAXIAO。 UncleDELINGMINDUFUHEXINGYEGAOBIAOZHUN,KEYIZAIDIZHI0.05mg/mLDENONGDUXIAJIANCEDANBAIZHIDEDAXIAO。 SHIYONGDLSKEYISHIBIEJUJITIHUOZAZHIDECUNZAI,BINGQUERENFENZISHIFOUSHIQIWANGDEDAXIAO。LINGWAI,KEYI15-95°CZHIJIANDERENHEWENDUXIAHUODELIJINGXINXI。

河南快赢481DUOFENSANXINGSHIYANGPINBUJUNYUNXINGDEHENGLIANGBIAOZHUN,RUGUOKELICHICUNBUJUNYUN,JIANGJIANCEDAOJIAOGAODEDUOFENSANXINGZHI。 DIDUOFENSANXINGZHIBIAOMINGKELICHICUNGENGJUNYUN。UncleZAIJIANCELIJINGDETONGSHIBUSHIYONGRENHEEWAIDEDANBAIZHIHUOTIANJIARENHESHIJIAN,JIKEHUODEYOUGUANDUOFENSANXINGDEGENGDUOXINXI,BINGKEZAIXIANGTONGYANGPINSHANGJINXINGQITASHIYAN。

 

方法:河南快赢481将9μL 0.5mg/mL的单克隆抗体加载到Uni管中,并在62℃保持16小时,每10分钟测量4次DLS数据,每次5秒。 在开始(t = 0)和结束(t = 16小时)时样品的尺寸分布显示在图中(图7)。

 

结果:在运行开始时,抗体在预期大小处有一个峰,并且多分散性值低于0.1,表明为单分散性样品。 在62℃孵育16小时后,在该制剂的Tm或Tagg温度以下,存在两个不同(较大)的峰,并且多分散性已增加至高于0.5,表明聚集体有显著的增加。

 

8.升温粒度

QUEDINGHUOQUERENSHENGWUZHIJIREWENDINGXINGDELINGYIZHONGFANGFASHIYONGDLSCELIANGDANBAIZHIDELIUTIDONGLIXUELIJINGDAXIAO,YINWEIDANBAILIJINGZAIREYINGJIXIAHUIJINGLIGOUXIANGBIANHUA。TONGGUODLSCELIANGLIJINGDEZENGJIASHIDANBAIGOUXIANGZHANKAIDEZHENGJU。RANER,ZAIJUJIKAISHIHOU,JINYONGGUANGSANSHEBUNENGQUEDINGZHENZHENGDERONGRONGWENDU。 UncleDEDUOZHONGJIANCEMOSHIKEGENGQINGXIDILEJIEDANBAIZHIGOUXIANGDEZHANKAIHEJUJI,CONGERKEKAODIJIANCEDANBAIZHIDEGOUXIANGBIANHUA。

 

方法:河南快赢481将9μL0.5mg/ mL的单克隆抗体加载到Uni管中,并以40-74℃的热升温运行,升温速率为0.3℃/分钟。每次检测都进行两次DLS信号采集,每次采集3秒。

 

结果:温度在70℃之前,总体平均粒径和散射光强度保持恒定;温度在70℃左右,两种检测值均显著增加(图8)。这与该制剂中抗体的第二次构象展开相对应。

 
   

TU6:DANBAIZHIZAILIULUNJIAREHELENGQUEHOUDEREBIANXINGHUIFU。

 
   

 

 

9.kD:(扩散相互作用系数)

Uncle能确定蛋白质在不同配方中的扩散相互作用系数,以帮助预测其胶体稳定性或聚集的可能性。在结构和制剂配方缩小到更小范围后,使用这种非侵入式技术可以验证优化后的条件。另外,只需一次实验和几分钟的时间即可以同时获得B22值。

 

方法:配制不同pH,不同缓冲液(乙酸钠,组氨酸或磷酸盐)终浓度15mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)。通过光吸收检测蛋白确切的浓度,并且在每个pH条件下进行6次稀释,直至2mg / mL。将每种样品取9μL加载到Uni管中,每个样品三次重复。采集4次DLS数据,每次5秒。 Uncle分析软件使用每个样品测量的流体动力学粒径,结合制剂信息,计算扩散系数。通过拟合直线的斜率和截距来计算kD值。

 

结果:强阳性的kD值(如该蛋白质在pH7条件下所见)表明蛋白净排斥相互作用(图9)。 kD值随pH降低而降低。在pH 4时,负kD值表明蛋白之间的净吸引相互作用。这与之前在这些条件下对BSA的检测结果*。

 

       
       
 

10.B22:(第二维里系数)

第二维里系数是研究样品中蛋白质分子之间相互作用的既定且有价值的方法。在测量kD的同时,使用完全相同的样本,即可获得独立计算的B22测量结果,通过它帮助预测蛋白质在制剂配方中的聚集倾向。正B22河南快赢481值表示蛋白质分子之间的净排斥力,而负B22值表明蛋白质易于自我结合。

 

方法:在Uni管中测量甲苯散射强度,以校准仪器的标准参数。配制不同pH,不同缓冲液(乙酸钠,组氨酸或磷酸盐)终浓度15mg / mL的牛血清白蛋白(BSA)。通过光吸收检测蛋白确切的浓度,并在每个pH条件下进行6次稀释,直至2mg / mL。将每种样品取9μL加载到Uni管中,每个样品三次重复。采集4次DLS数据,每次5秒。 Uncle软件使用每个样本的光散射强度来计算Kc/R值,通过数据拟合线的斜率计算B22

 

结果:强阳性的B22值(如在该蛋白质的pH7条件下所见)表明净排斥相互作用,这与相同条件下独立测量的kD值*(图10)。同样地,在pH4时,负B22值表明分子之间有相互吸引的作用,因此该条件不是该蛋白质的有利制剂。

 

11.G22 : (Kirkwood-Buff Integral)

G22是一种更严格的检测蛋白质的净自身相互作用参数的方法,特别是在高浓度时,G22可以确定样品中的蛋白质-溶剂和蛋白质-溶质相互作用。与B22不同,阴性G22值表示蛋白质分子之间的净排斥力,而阳性G22表示可能的自结合。这节省宝贵的样本和时间,可以对B22数据重新分析,以获得在蛋白高浓度时的G22值。

 

方法:在Uni管中测量甲苯散射强度,以校准仪器的标准参数。在pH5的40mM乙酸钠缓冲液(含或不含300M NaCl)中制备80mg / mL的α-胰凝乳蛋白酶原。通过光吸收测量蛋白浓度,并6次稀释蛋白至20mg / mL。将每种样品取9μL加载到Uni管中,每个样品三次重复。采集4次DLS数据,每次5秒。Uncle软件使用每个样品的光散射强度来计算R90/K值,其与蛋白质的预期分子量一起使用计算不同条件下蛋白质的G22值。

 
   

图11:在pH 5的条件下,蛋白质浓度与散射强度的函数关系,以及蛋白质高浓度(80mg / mL)时的G22值。

 

结果:R90/K的强烈上升趋势(如该蛋白质在300M NaCl制剂中的条件所示)表明净吸引相互作用,这与在相同条件下高蛋白质浓度时计算的阳性G22值*。不含NaCl的蛋白质制剂在高蛋白质浓度时显示出R90/K的适度增加以及负G22值,表明该蛋白质在此条件下不具有自结合的倾向。

 

 

  1. 黏度

UncleKEYIBIJIAOBUTONGDANBAIZHIDENIANDU,BINGZAIZHIJIKAIFAGUOCHENGZHONGGENGZAODILEJIEPEIFANGCHENGFENHUOFUXINGJIRUHEZENGJIAHUOJIANGDIRONGYEDENIANDU。UncleXUYAODEYANGPINLIANGBICHUANTONGDEZHANDUJIXIAO,YINCIKEYIYONGGENGSHAODEDANBAIZHISHAIXUANGENGDUODETIAOJIAN。

 

方法:对于甘油标准品,将1μL的100nm聚苯乙烯微珠和1μL的吐温溶液分别与100μL10种不同浓度的甘油溶液(0至67%(w/w))混合。对于蛋白质样品,以PBS为缓冲液制备浓度范围为1-300mg/mL的BSA溶液,并将每种样品与100nm聚苯乙烯微珠和稀释后的吐温混合,不含蛋白质的样品用于标准微珠粒径检测。将每种样品取9μL加载到Uni管中,并在23℃进行4次数据检测,每次5秒。对于甘油标准品,用PBS替代微珠样品,将数据与在Rheosense microVISC上收集的黏度测量值相关联。

 

甘油结果:河南快赢481使用Uncle和粘度计测定的甘油溶液黏度结果之间存在极好的相关性(图11A),黏度高达14cP。对于每种仪器,将三次读数取平均值以获得图表上的值,但是每次测量时Uncle仅需要9μL样品,而粘度计需要400μL样品。

 

蛋白质结果:用Uncle测量浓度高达300mg/mL的BSA溶液的黏度,黏度值高达4cP,且具有重复性(图11B)。对于这种牛顿流体的黏度值与之前报道的通过其他方法获得的值相符。

 

       
       
 

 

TU12:ZAIUncleHEZHANDUJI(A)SHANGCELIANGDEGANYOUBIAOZHUNPINNIANDUZHIDEXIANGGUANXING,YIJIYOUUncle(B)CELIANGDEDANBAIZHINONGDUZENGJIASHIDENIANDUZHI。

 

 

小结

Uncle结合了三种检测方法,可在单一平台上实现更稳定的测量。通过组合各检测方法,为研究人员提供了更大的灵活性; 例如,可以通过热熔融和聚集跟踪粒径和多分散性系数。 在某些情况下,可以同时获得两组值(例如kD和B22)。总之,使用一台仪器可以完成12种不同的应用,大大降低了蛋白质样品的体积要求,而且避免需要使用几种单一测量仪器来确定稳定性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

       
       
 

 

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